Нанообъекты как новая биологическая угроза


СТАТЬИ КНИГИ ФОРУМ ГОСТЕВАЯ КНИГА ССЫЛКИ ОБ АВТОРЕ



Автор: Михаил Васильевич Супотницкий.

Об авторе : Михаил Васильевич Супотницкий - кандидат биологических наук.


Реферат. Первое боевое применение веществ нанодиапазона состоялось в июле 1917 г., когда германской армией на Западном фронте были применены специальные снаряды, переводящие арсины в агрегаты размером менее 100 нм, свободно преодолевавшие угольные фильтры противогазов. В настоящее время нанообъекты представляют собой новую биологическую угрозу, с трудно прогнозируемым поражающим потенциалом. Цель работы — обозначение контуров проблемы поражающего действия нанообъектов. К нанообъектам относятся наночастицы известных веществ, полученные путем их дезагрегирования или конденсирования, а также искусственно созданные конструкции, способные переносить генетическую информацию (искусственные генетические конструкции) или осуществлять механические действия (наномеханизмы) в диапазоне размеров до 100 нм. Известно не менее шести путей проникновения нанообъектов в организм человека — через легкие, обонятельный эпителий, кожу, желудочно-кишечный тракт, барьеры глаза и парэнтерально. Нанообъекты могут вызывать смертельные поражения людей, проявляющиеся клиникой болезни, неизвестной врачам, либо она может маскироваться под уже известные описания, однако иметь совершенно иную этиологию, чем та, что традиционно рассматривается врачами при выборе способов лечения пациентов. В зависимости от структуры, состава, физических свойств и способа проникновения в организм человека, нанообъекты оказывают разрушительное действие на легочную ткань, проявляют нейро-, дермо- и генотоксичность. Наибольшую опасность представляют нанообъекты размером менее 50 нм, способные доставлять генетическую информацию в ядро клетки, формирующие инкапсулирующие структуры или биофункционализированные. Распознание вызванных ими поражений невозможно без определения случая поражения, т. е. формирования стандартного клинического, паталогоанатомического и патоморфологического описания случая болезни, вызванного определенным типом нанообъекта.

Супотницкий М.В. Нанообъекты как новая биологическая угроза // Нанотехнологии и охрана здоровья. — 2013. — № 4. — С. 22–41.

 

 

Нанообъекты — это огромный мир в диапазоне наноразмеров. К ним относятся наночастицы известных веществ, полученные путем их дезагрегирования или конденсирования; искусственно созданные конструкции, способные переносить генетическую информацию (искусственные генетические конструкции); и конструкции, способные осуществлять механические действия (наномеханизмы). D. M. Goncalves et al. [23] пишут о необходимости формирования новой ветви токсикологии — нанотоксикологии, т. е. науки, изучающей потенциальную опасность наноструктур и наномеханизмов. Цель настоящей работы — обозначение контуров проблемы поражающего действия нанообъектов.

Границы наномира. Наномир представлен структурами нанометрового диапазона размеров (1 нм = 10-9 м = 10-6 мм = 10-3 мкм), но это не значит, что если объект измерять нанометрами, то мы проникнем в наномир. Размер атомов и атомных молекул около 0,1 нм, но наноструктурой отдельный атом не является. В химии принято считать, что наноструктурой становится результат самоконденсации атомов и молекул в малые атомные агрегации (кластеры), являющиеся промежуточным звеном между изолированными атомами и молекулами (с одной стороны), и массивным (объемным) твердым телом, с другой. Отличительной чертой кластеров атомов (молекул) от исходных атомов (молекул) является «немонотонная зависимость свойств от количества атомов в кластере». Переход к твердому телу осуществляется через укрупнение кластеров — минимальное число атомов в кластере равно двум, верхняя граница соответствует числу атомов, когда добавление еще одного атома не меняет свойства кластера, так как переход количественных изменений в качественные уже закончился. Обычно такая структура соответствует 1–2 тыс. атомов и она является границей между кластером и изолированной наночастицей. Следовательно, нижняя граница наномира начинается в диапазоне размеров от 1 до 4 нм, т. е. с образованием твердого тела — наночастицы. Верхнюю границу наномира определяют свойства приповерхностного слоя наночастицы. Дело тут в том, что доля атомов (α), находящихся в тонком приповерхностном слое (~1 нм) растет с уменьшением размеров частички вещества R, поскольку α ≈ S/V ≈ R2/R3 ≈ 1/R (здесь S — поверхность частички, V — ее объем). Атомы, дислоцирующиеся на поверхности частички, обладают свойствами, отличающимися от «объемных», поскольку они связаны с окружающими их атомами по-иному, нежели в объеме. В результате ненасыщенности связей на поверхности наночастицы может произойти атомная реконструкция и появится новый порядок расположения атомов. На свободных поверхностях могут находиться атомы и молекулы, адсорбированные из внешней среды; дополнительные особенности появляются в окрестностях атомов, находящихся на краях моноатомных террас, уступов и впадин. Взаимодействие электронов со свободной поверхностью тоже приводит к возникновению специфических приповерхностных явлений. Возникают и другие эффекты, более подробно о них можно узнать в специальной литературе (например, из монографий Головина Ю. И. [1]; и Суздалева И.П., [3]). Все это вместе взятое позволяет химикам рассматривать приповерхностный слой частиц, у которых соотношение числа атомов (молекул) лежащих на поверхности, больше или равно объемным, как некое новое состояние вещества. Внешне оно проявляется резким увеличением химической и каталитической активности поверхности, увеличением ее сорбционной емкости и другими эффектами. Поэтому в химии под наночастицами понимают те, у которых отношение числа поверхностных атомов (молекул) к объемным ≥ 1. При таком определении наночастицами низкомолекулярных веществ считаются объекты с размером до 10 нм, для высокомолекулярных до 100 нм.

Первое боевое применение частиц нано- и субмикронных размеров. После появления во второй половине 1916 г. на фронтах Мировой войны угольных противогазов, многие военные специалисты считали, что теперь «противогаз победил газ». Однако в июле 1917 г. германские военные во Фландрии доказали войскам Антанты обратное. И дело было не только в том, что были применены новые отравляющие вещества (ОВ) раздражающего действия — арсины (дифенилхлорарсин, адамсит, дифенилцианарсин). Изменилось агрегатное состояние боевых отравляющих веществ. Арсины, в отличие от использовавшихся ранее фосгена, дифосгена, хлора, синильной кислоты, представляют собой твердые вещества. Температура кипения дифенилхлорарсина 333 оС; адамсита — 277,5 оС; дифенилцианарсина — 346 оС. Их плавили и заливали стеклянные емкости, затем эти емкости помещали в корпуса снарядов и заливали тротилом. Снаряды маркировались синим крестом. При взрыве тротила арсины превращались в пар и мгновенно конденсировались с образованием наноагрегатов размером менее 100 нм (предел разрешения методов измерения размеров частиц в то время). Такой способ образования наночастиц называется сегодня самоконденсацией. Для получения наночастиц заданного размера и структуры он выполняется в специальных камерах и атмосфере инертного газа низкого давления с последующей конденсацией пара в охлаждающей среде или на охлаждающих устройствах. Но в 1917 г. размер и структура получаемых твердых частиц арсинов германское командование не интересовали. Целью применения таких снарядов было заставить солдат противника сбросить противогазы и получить смертельное поражение вдохнув пары фосгена и дифосгена, образовавшихся в результате одновременного обстрела химическими снарядами другого типа, маркировавшихся зеленым крестом (рис. 1).

Рис. 1. Нано- и субмикронные частицы арсинов против противогазов.

Рис. 1. Нано- и субмикронные частицы арсинов против противогазов. А. Схема германского химического снаряда «синий крест» (1917–1918 гг.): 1 — ОВ (дифенилхлоарсин); 2 — футляр для ОВ; 3 — разрывной заряд; 4 — корпус снаряда. Б. Британский малый коробчатый противогаз начала 1918 г. — лучший противогаз Первой мировой войны: 1 — пружина; 2 — слой угля; 3 — химический поглотитель; 4 — слой угля; 5 — медная сетка. Защищал до 30 мин от фосгена в концентрации в атмосфере 1%, но был бесполезен для защиты от частиц арсинов нано- и субмикронных размеров [5]

 

Частицы арсинов свободно преодолевали угольные фильтры противогазов и вызывали у солдат сильный рвотный рефлекс. Борьба с такими «дымами» оказалась более сложной, чем с ОВ, применявшимися в парообразном состоянии. До конца войны не было создано удовлетворительных противодымных фильтров. Артиллерийская подготовка, проводимая одновременно химическими снарядами синего и зеленого крестов, получила у германских военных красивое название — «стрельба разноцветным крестом» [3].

Особенности наночастиц, обуславливающие их поражающее действие. Прежде всего, это химическая и каталитическая активность поверхности наночастиц, отсутствующая у этого же вещества при более крупной дисперсности частиц. Второй особенностью наночастиц, проявляющейся их токсичностью, является их высокая концентрация в воздухе при незначительном количестве самого распыленного вещества. Например, 10 мкг/м3 вещества образует более чем 1х106 частиц/см3 при их размере в 20 нм. Третья особенность наночастиц, проявляющаяся их токсическими свойствами, это их способность к ингаляционному, трансдермальному, транснейральному и энтеральному проникновению в любые органы и ткани человека, включая ЦНС. Четвертая особенность наночастиц, проявляющаяся генотоксическим действием — их способность проникать в ядра неделящихся клеток, если диаметр частиц менее 50 нм, т.е. размера внутренней полости поры ядра клетки [2, 13]. Физические свойства частиц наноразмеров, определяющие их распространение в организме человека и поражающее действие, приведены в табл. 1.

 

 

 

 

 

 

Таблица 1

Физические свойства частиц наноразмеров, определяющие их распространение в организме человека и поражающее действие

Физические свойства

Распространение наночастиц в организме человека

Поражающее действие

Размер

Определяет ее биодоступность и продолжительность циркуляции в кровеносном русле. Частицы размером <5–10 нм удаляются из организма путем почечного клиренса; >200 нм депонируются (sequestered) в селезенке. Частицы размером до 70 нм могут пенетрировать капилляры. Нанокомплексы размером в пределах 35–120 нм собираются в лимфатических узлах. Частицы менее 40 нм способны  проникать в ядро клетки.

Размер частицы определяет механизм ее интернализации в клетку (фагоцитоз, эндоцитоз, пикноцитоз) и внутриклеточную локализацию, а также то, будет ли она опсонизирована белками сыворотки плазмы, фагоцитирована макрофагами или удалена клетками РЭС

Варьирование размером наночастицы позволяет более точно нацелить на клетки, содержащие специфические сайты для наночастицы, тем самым уменьшить их поражающую дозу

Мультифункциональность

Размер частицы определяет ее биодоступность и создание более высоких концентраций в органах-мишенях, структура той же частицы (например, нанотрубка) позволяет использовать ее в качестве носителя токсического соединения в клетку-мишень, поверхность частицы определяет ее сродство к определенному рецептору и др.

Повышение специфичности поражающего действия наночастиц

Большая площадь поверхности

Плохо растворимые в воде токсические вещества могут быть сорбированы на поверхности частиц

Расширение круга поражающих агентов

Высокий поверхностный заряд

Поверхность клетки имеет отрицательный заряд, придание частице положительного заряда повышает ее проникающий потенциал. Позволяет повысить эффективность доставки в клетки химических и биологических соединений, имеющих отрицательный заряд

Снижение поражающей дозы и расширение круга поражающих агентов

Формирование стабильных структур, способных инкапсулировать химические и биологические соединения (нанокапсулы и нанотрубки)

Инкапсуляция позволяет защитить биологическое или химическое соединение от действия факторов внешней среды при хранении, переводе в аэрозоль, нахождении в аэрозолированном состоянии и от воздействия факторов организма (кислая среда желудочного сока, иммунные ответы и др.), а также доставлять в клетки плохо растворимые в воде соединения. Но только частицы размером менее 100 нм могут попасть вовнутрь везикулы в ходе эндоцитоза, что определяет наиболее оптимальный размер наночастиц, включающих биологические активные соединения, должен находиться в пределах от 10 до 100 нм

То же

Возможность биофункционализации

Достигается путем присоединения наночастиц к биоактивным молекулам. Например, присоединение к ПЭГ (пэгилирование) продляет длительность циркуляции наночастицы в крови, уменьшает их взаимодействие с опсонизирующими белками; конъюгирование с белками-лигандами повышает эффективность проникновения наночастиц в клетки-мишени

Снижение поражающей дозы

 

Наночастицы по размеру сходны с рецепторами клеток и молекулами, осуществляющими сигнальную функцию внутри клетки. Исследования, проведенные в условиях in vitro с использованием различных клеточных систем, показали развитие у клеток, экспонированных к наночастицам, прововоспалительных и связанных с окислительным стрессом реакций [13, 18, 23, 34] (рис. 2).

Токсическое действие наночастиц на культуры клеток зависит от типа клетки-мишени, условий среды, в которой произошло взаимодействие наночастицы с клеткой, химического состава наночастицы, ее размера, формы, химии поверхности и дозы [53].

В условиях in vivo, наночастицы вызывают различные патологические реакции. В зависимости от способа проникновения в организм человека и физических свойств (см. табл. 1) они могут оказывать разрушительное действие на легочную ткань, проявлять нейро-, дермо- и генотоксичность. Без экспериментального исследования на лабораторных животных наночастиц конкретного вещества, структуры, определенного диапазона дисперсности и степени агрегации частиц, их патологическое действие можно только предполагать. Однако даже если оно установлено в эксперименте или эпидемиологическим исследованием, необходимо понимать, что это действие воспроизводимо только в тех условиях, в которых оно обнаружено. На другие условия эксперимента мы можем его только экстраполировать, как это показано на рис. 3 для наночастиц, оказывающих нейротоксическое действие.

Рис. 2. Гипотетический механизм клеточного взаимодействия с частицами наноразмера.

Рис. 2. Гипотетический механизм клеточного взаимодействия с частицами наноразмера. Проникшие в клетку наночастицы металла вызывают окислительный стресс, тем самым увеличивая внутриклеточное содержание кальция и активируя отдельные гены. EGFR (epidermal growth factor receptor) — рецептор эпидермального фактора роста. NF-kB (ядерный фактор кВ) — основной транскрипционный активатор воспалительных цитокинов. По [18]

 

 

 

 

 

 

Например, при исследовании в условиях in vitro ответов микроглии на частицы кварца размером 200 нм, обнаружено, что они не обладают токсическим эффектом даже при высоких концентрациях (292 мкг/мл). Частицы того же вещества размером 50 нм уменьшают количество живых нейронов дозозависимым образом [6]. Наночастицы меди размером 40 нм обладают максимальным токсическим эффектом на соматосенсорные нейроны в сравнении с таким же эффектом, оказываемым наночастицами меди размером 60 и 80 нм [47].

В патологических эффектах нанообъектов, проявившихся в уcловиях in vivo при одном способе введения, прослеживается определенная специфичность, обусловленная их структурой и химическим строением. Например, агрегированные одностеночные углеродные нанотрубки в легочной ткани мышей индуцируют образование гранулем, главным образом связанных гипертрофией эпителиальных клеток. Эти же трубки, но в диспергированном состоянии, вызывают развитие диффузного интерстициального фиброза с утолщением стенок альвеол [51].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 3. Нейротоксическое действие наночастиц.

Рис. 3. Нейротоксическое действие наночастиц. А. Предполагаемый механизм нейротоксического действия наночастиц. По [59]. Б. Общие закономерности проявления нейротоксичности при экспонировании к наночастицам. Нейротоксичность выше при меньшем размере частиц, большей концентрации, большей величине положительного заряда и длительности экспонирования. По [32]

 

Внутренний объем нанотрубок может быть заполнен токсическими соединениями биологической и химической природы. Стенки нанотрубок исключат взаимодействие биологических компонентов с клетками иммунной системы и последующие иммунные ответы. Благодаря достижениям в конструировании таких структур стала возможной доставка биологически активных веществ и генов в клетки, очень трудные для трансфекции, включая В-клетки и первичные нейроны [22, 36].

Искусственные генетические конструкции. Разрабатываются в рамках технологий генной терапии наследственных и инфекционных болезней. Предназначены для доставки генов в клетки-мишени. В настоящее время сформировалось два альтернативных направления их создания на основе вирусов и на основе искусственных векторных систем (табл. 2).

 

 

Таблица 2 – Сравнение свойств наиболее распространенных генотерапевтических векторных систем

Характеристика

Гамма- ретровирусные (MLV, FLV и др.)

Лентивирусные (ВИЧ-1 и ВИЧ-2, FIV, CAEV, EIAV, JDV, MVV и др.)

Аденовирусные (Ad)

Вирус герпеса первого типа (HSV-1)

Аденоас-социированный вирус (AAV)

Плазмидная ДНК (в искусственной векторной системе)

Размеры частицы, нм

80–100

80–100

70–90

120–300

20

15–5000

Максимальный размер вставки, т.п.о.

7–7,5

7–7,5

До 30

До 30 (на основе рекомбинантного вируса), до 150 т.п.о. на основе ампликона

3,5–4,0

Неограничен

Концентрация (количество вирусных частиц в мл)

>108

>108

>1011

До 108 (на основе ампликона)

>1012

Неограничена

Схема доставки генов

Ex vivo

Ex/in vivo

Ex/in vivo

In vivo

Ex/in vivo

Ex/in vivo

Интеграция с ДНК реципиента

Возможна

Возможна

Невозможна

Невозможна для ампликонов

Возможна/ невозможна

Маловероятна

Продолжительность экспрессии in vivo

Короткая

Продолжительная

Короткая

Короткая

Продолжительная

Короткая

Стабильность

Хорошая

Не проверялась

Хорошая

Нестабилен

Хорошая

Очень хорошая

Легкость приготовления

Пилотные установки размером 20–50 л

Неизвестно

Легко масштабируется

Неизвестно

Трудно очищать от клеточных фрагментов и масштабировать производство

Легко получать в больших количествах

Иммунологические проблемы

Незначительны

Незначительны

Серьезны

Незначительны для ампликонов

Неизвестны

Нет

Наличие иммунитета у реципиента

Маловероятно

Маловероятно, за исключением больных СПИДом

Возможно

Возможно

Возможно

Невозможно

Проблемы безопасности

Инсерционный мутагенез?

Инсерционный мутагенез?

Воспалительный ответ, токсичность

Незначительны для ампликонов

Воспалительный ответ, токсичность

Преодолимы в рамках подбора нетоксичных компонентов системы

* Таблица составлена по работам [11, 31, 42, 46, 49].

 

Искусственные генетические конструкции на основе вирусов в организме человека имитируют поведение вирусной частицы, но не вызывают инфекционный процесс. В их состав входят: белки вируса, формирующие оболочку частицы, способную к узнаванию клеток-мишеней и к интернализации в цитоплазму; и трансген-экспрессирующая кассета, осуществляющая после доставки в клетку длительную экспрессию одного или нескольких генов.

Наибольшее распространение в практике генной терапии наследственных и инфекционных болезней приобрели векторные системы на основе лентивирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, ортопоксвирусов, герпесвирусов и отдельных РНК-вирусов (вирусов гриппа, бешенства, везикулярного стоматита, кори, респираторно-синтициальной болезни, лихорадок Синдбис, Сендай, ВЭЛ и др.), не относящихся к ретровирусам.

Искусственные векторные системы разрабатываются по трем направлениям: комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и катионными полимерами (полиплексы); комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и липидами (липоплексы); комплексы на основе наночастиц двуокиси кремния. На рис. 4 показаны механизмы формирования первых двух комплексов и их проникновения в клетку.

Третьим направлением получения искусственных векторных систем, развитие которого прослеживается только с 2005 г., стало использование наночастиц двуокиси кремния в качестве носителя терапевтических генов. Их основными преимуществами перед липо- и полиплексами разработчики считают низкую токсичность, контролируемость размеров и простоту приготовления векторной системы [10, 14].

Рис. 4. Механизмы формирования искусственных векторных систем наноразмера и их проникновения в клетку.

Рис. 4. Механизмы формирования искусственных векторных систем наноразмера и их проникновения в клетку. А. Формирование комплекса. Имеющие отрицательный заряд нуклеиновые кислоты взаимодействуют с катионными липидами или поликатионами через электростатические взаимодействия. В результате формируются положительно заряженные липоплексы или полиплексы. Б. Положительно заряженные наночастицы связываются со специфическими рецепторами или непосредственно с поверхностью клетки. Комплексы проникают в клетку по механизму эндоцитоза. После высвобождения из эндосомы и разборки комплекса, нуклеиновая кислота проникает через поры в ядро клетки. По [27]

 

Наиболее распространенным вариантом конструирования искусственных векторных систем стало создание комплексов наноразмеров, подвергающихся декомплексации в эндосомах и высвобождающих ДНК трансгена в цитоплазму. Нанополиплексы размером меньше 25 нм эффективно трансфецируют неделящиеся клетки, так как они меньше чем размер пор в мембране ядра. Нанополиплексы стабильны в солевых растворах. Конденсированный пептид, содержащий в своей структуре тридцатимерный полилизин с цистеином на N-конце, к которому «пришит» 10 кДа ПЭГ, при температуре 4°C стабилен в солевом растворе более трех лет; 9 мес. он сохраняет свои основные свойства при комнатной температуре, и один месяц при температуре 37°C [17].

Перечисленные подходы к конструированию искусственных векторных систем позволяют разрабатывать векторы с тонко управляемой специфичностью для направленной доставки трансгенов в целевые клетки (в печень, надпочечники, глубокие отделы мозга, медуллярные двигательные нейроны, костные ткани, гладкую мускулатуру кровеносных сосудов, легочную ткань, опухоли эндотелия и др.).

Пути проникновения нанообъектов в организм человека. Их не менее шести — через легкие, обонятельный эпителий, кожу, желудочно-кишечный тракт, барьеры глаза и парэнтерально. Наиболее доступны для наночастиц легкие. В газобменной области альвеол барьер между альвеолярной стенкой и капиллярами очень тонок, всего 500 нм и легко проницаем для объектов наноразмеров [30]. Распространение наночастиц по дыхательным путям показано на рис. 6.

До 90% ингалированных 1-нм частиц оседает в назофарингеальном тракте, до альвеол они «не доходят». 5-нм частицы распределяются относительно равномерно по нанофарингельному тракту, трахеобронхиальному тракту и альвеолам (~ по 30%). Частицы диаметром в 20 нм наиболее эффективно оседают в альвеолах (~ 50%). В тоже время в трахеобронхиальном и назофарингеальном регионах задерживается ~ по 15 % от их общего количества.

Скорость проникновения нанообъектов из легких в кровеносное русло варьирует для наночастиц разных размеров и химического состава. В некоторых случаях этот процесс может осуществляться очень быстро. A. Nemmar et al. [42] установили, что ингалированные углеродные частицы размером менее 100 нм, уже через одну минуту после экспозиции можно обнаружить в крови экспериментального животного.

Рис. 5. Фракционное отложение ингалированных частиц в назофарингеальном (1), трахеобронхиальном (2) и альвеолярном (3) регионах респираторного тракта при носовом дыхании.

Рис. 5. Фракционное отложение ингалированных частиц в назофарингеальном (1), трахеобронхиальном (2) и альвеолярном (3) регионах респираторного тракта при носовом дыхании. По [44]

 

По данным Choi H. S. et al. [15] некатионные наночастицы размером менее чем ~ 34 нм способны перемещаться из легких в лимфатические узлы средостения. Такие же наночастицы размером <6 нм проникают из легких в кровь, а затем выводятся из организма почками. Наночастицы, покрытые сурфактантом, выстилающим стенки альвеолы, более эффективно проникают через альвеолярно-капиллярную мембрану (alveolar–capillary membrane), чем частицы, не имеющие такого покрытия [7].

Наибольшим токсическим потенциалом для легочной ткани обладают углеродные нанотрубки (carbon nanotubes, CNT). Их диаметр измеряется в нанометрах, длина может достигать сотен микрон. Такие структуры имеют сходство с нитями асбеста. Экспериментальные результаты, полученные в условиях in vitro F. A. Murphy et al. [40], показывают, что прямое экспонирование к CNT ведет к значительному цитокиновому выбросу макрофагами, но не клетками мезотелия. Выраженность этих провоспалительных ответов макрофагов зависит от длины нитей CNT. Она меньше чем ожидалось при проведении аналогии с нитями асбеста. К тому же действие CNT на клетки мезотелия носит непрямой характер. Мезотелиальные клетки реагируют на цитокины, выброшенные макрофагами во время незавершенного фагоцитоза CNT. Поэтому авторы выдвинули гипотезу, что этот механизм лежит в основе воспаления, развивающегося в плевральной полости человека в ответ на проникновение туда нанонитей. Данные по острой легочной токсичности CNT приведены в табл. 2.

 

Таблица 2 – Результаты исследования острой легочной токсичности CNT*

Животное

Наночастица

Путь введения/продолжительность исследования

Доза

Патологический эффект/повреждение

Мышь

MWCNT

И/т через 1, 2, 3, 7и 30 сут

1; 2,5 и 5 мг/кг

Зависимые от дозы летальность и воспаление; зависимые от дозы и времени экспонирования фиброз и гранулемы

Морская свинка

MWCNT

И/т, 90 сут

15 мг/животное

Неспецифическая десквамативная интерстициальная пневмония

Мышь

SWCNT

То же

0,1 и 0,5 мг/животное

Гибель животных в группах с наибольшей дозой, прогрессирующие и зависящие от дозы мультифокальные эпителиальные гранулемы

Крыса

MWCNT

И/т, 1 и 2 мес.

0,5; 2,0 и 5 мг/животное

Дозозависимое развитие воспаления и фиброза

Мышь

SWCNT

Фарингеальная аспирация, 1, 3, 7, 28 и 60 сут

40 мкг/животное

Транзиентные воспалительные ответы, зависящие от дозы эпителиоидные гранулемы, интерстициальный фиброз и утрата легочной функции

Крыса

SWCNT

И/т, 24 ч, 1 нед.; 1 и 3 мес.

1 и 5 мг/кг

Смерть при наиболее высокой дозе, вызванная механической асфиксией из-за обструкции верхних дыхательных путей, вызванной агрегацией наночастиц; транзиентные воспалительные ответы и неспецифические повреждения; непрогрессирующие и не зависящие от дозы мультифокальные гранулемы

* По [56].

 

Своеобразной «новинкой» для токсикологов, характерной именно для частиц нанодиапазона, является возможность их проникновение в ЦНС по нервным волокнам, идущим от обонятельного эпителия и сетчатки глаза (рис. 6).

Рис. 6. Проникновение наночастиц в мозг через обонятельный эпителий носовых ходов.

Рис. 6. Проникновение наночастиц в мозг через обонятельный эпителий носовых ходов. По [44]

 

D. H. Jo et al. [32] показали проникновение в мозг через сетчатку глаза наночастиц золота размером 20 нм, введенных внутривенно.

Установлены три пути проникновения частиц наноразмеров через кожу: в промежутки между клетками, через клетки и через волосяные фолликулы. Например, липоплексы с размерами в пределах от 20 нм до 200 нм легко «проходят» между клетками. Проникновение в организм человека через кожные покровы для наночастиц облегчается тонкостью верхнего слоя кожи, эпидермиса. Лежащий же под ним слой — дерма, богат макрофагами крови и тканей, лимфатическими узлами, дендритными клетками и в него «выходят» окончания сенсорных нервов пяти различных типов; все эти «обитатели» дермального слоя способны поглощать и распространять нанообъекты за пределы их первоначальной аппликации [44].

S. S. Tinkle et al. [58] продемонстрировали способность неповрежденной кожи в местах сгиба, например, в области запястья, становиться проницаемой для наночастиц. L. Mortensen et al. [39] опубликовали экспериментальные данные, показывающие значительное увеличение проницаемости кожи для наночастиц после ультрафиолетового облучения.

При внутривенном введении способность нанообъектов распространятся в организме животного и человека зависит от их размеров. Например, частицы золота размером 10 нм при внутривенном введении крысе были обнаружены в крови, печени, селезенке, почках, яичках, тимусе, сердце и мозге. Частицы этого же вещества, но более крупного размера (50, 100, 250 нм), обнаружены только в крови, печени и селезенке экспериментального животного [33]. D. H. Jo et al. [32] показали способность введенных внутривенно частиц золота размером 20 нм проникать во все слои сетчатки глаза, включая нейрональный, эндотелиальный, и в периэндотелиальные глиальные клетки, однако частицы золота размером 100 нм, не проникали в ткани сетчатки. Из циркулирующих в крови наночастиц, ГЭБ способны преодолевать катионные наночастицы и, в высоких концентрациях (!) анионные наночастицы [35].

Кишечник значительно более проницаем для наночастиц, чем для частиц микронного размера благодаря тому, что поверхность его слизистой оболочки имеет поры диаметром до 100 нм. Положительно заряженные наночастицы проникают в кровеносное русло через кишечник значительно быстрее, чем отрицательно заряженные. Чем меньше размер частицы, тем меньшее влияние на скорость ее проникновения оказывает ее заряд [21].

Подробно с токсическими свойствами нанообъектов, производимых промышленным путем, можно ознакомится по работам [12, 38, 52, 56]. В табл. 3 приведены примеры острой системной токсичности нанообъектов в условиях эксперимента.

 

Таблица 3 – Острая системная токсичность нанообъектов в условиях эксперимента*

Животное

Нанообъект

Путь введения

LD50 (г/кг)

Патологический эффект

Мышь

Фуллерен (С60)

В/б

>2,5**

Смертельных исходов не наблюдалось, фуллерены обнаружены в селезенке и печени, гипертрофия перисинусоидальных клеток печени

Мышь

G7, катионный полиамидоаминный дендример

В/б

>0,045

Погибла 1/5 часть животных, вакуолизация печени***

Мышь

G3, катионный меламиновый дендример

В/б

0,040–0,160

Некроз печени

Крыса

Полисульфонированный фуллерен (С60)

В/б

0,6

Лизосомальная перегрузка почек, нефроз

Мышь

Полигидроксилированный фуллерен (С60)

В/б

1,2

Отмечено зависимое от дозы увеличение веса печени

Мышь

Zn, 58 нм

Per os

>5

Погибли 2 из 20 экспериментальных животных вследствие непроходимости кишечника. Расширение канальцев почек, отечная дегенерация печени (hydropic degeneration)

Мышь

Cu, 25 нм

Per os

0,4

Проксимальный тубулярный некроз почек, жировая дегенерация печени, атрофия селезенки

Мышь

TiO2, 25, 80 и 155 нм

Per os

>5**

Почки — расширение клубочков; печень — отечная дегенерация, очаговый некроз

* По [56].

** Указана максимальная доза.

*** Жирным шрифтом выделен орган-мишень.

 

Случай группового поражения людей наночастицами двуокиси кремния[1]. С января 2007 г. по апрель 2008 г. в Beijing Chaoyang Hospital в Пекине поступили 7 женщин в возрасте от 19 до 47 лет (средний возраст 29 лет), работавших на одном предприятии. Все они жаловались на отдышку и затрудненное дыхание. Объективно при поступлении: поверхностное дыхание; гипоксемия, но без задержки углекислоты; на лице, кистях рук и предплечьях интенсивная зудящая сыпь. Ультразвуковое исследование позволило обнаружить у всех пациенток плевральные выпоты, у пяти из них перикардиальный выпот глубиной 4–8 мм. Других патологических изменений со стороны сердца, почек и печени, не выявлено.

Ранее они проходили лечение в местных больницах, которое включало многократный торакоцентез, выполняемый для удаления жидкости из плевральной полости; антибиотикотерапию; антитуберкулезное лечение; преднизолон и метилпреднизолон. Все пациентки работали в одном плохо вентилируемом помещении площадью 70 м2, с одной дверью и без окон. В помещении установлена машина для воздушного распыления полиакрилатов на листы оргстекла, и последующего нагревания и высушивания полученных поверхностей. Поликрилатные покрытия обычно содержат связующее вещество, пигменты, растворители, наполнители и добавки. Наполнители и добавки представляют собой композиционные материалы, содержащие диоксид кремния, сульфат бария, карбонат кальция, силикаты (тальк, слюда или каолин).

Даже спустя 20 мес. после поступления в Beijing Chaoyang Hospital у пациенток обнаруживали ослабленное дыхание, продолжающееся истечение жидкости в плевру и медленно прогрессирующий легочный фиброз. У двух пациенток (случаи 1 и 5) плевральный выпот образовался чрезвычайно быстро, что потребовало установить непрерывный дренаж плевральной полости. В сутки врачи откачивали 300–800 мл плевральной жидкости. Наиболее тяжелой 19-летней пациентке (случай 5) через 18 мес. после начала болезни было выполнено оперативное вмешательство на грудной клетке под видеонаблюдением (VATS). Процедура включала фенестрацию (прокол) перикарда и откачивание почти 170 мл жидкости из перикардиального пространства, декортикацию плевральных фиброзных пластинок (decortication of pleural fibrous lamina), клиновидную резекцию плевры, легочную биопсию и дренаж плевральной жидкости. Через 24 ч после VATS у пациентки развился тяжелый пневмоторакс, на 10-е сут острая перикардиальная тампонада, которые не удалось купировать. Пациентка умерла на 16 сут после хирургического вмешательства на фоне легочной недостаточности. Течение болезни у 29-летней пациентке (случай 5) было сходным с вышеописанным. Она умерла от легочной недостаточности в местном госпитале через 21 мес. после появления первых симптомов болезни.

Общие анализы мочи у пациенток при поступлении в стационар были в пределах нормы. Общий анализ крови обнаружил моноцитоз с увеличением абсолютного количества моноцитов и нейтропению, с уменьшением абсолютного количества нейтрофилов, повышенную СОЭ, гипопротеинемию, повышенные уровни ALT и AST. Спирометрия показала снижение легочного объема. Иммунологические тесты были в пределах нормы.

Рентгенография и компьютерная томография грудной клетки показали наличие у всех пациенток плеврального выпота, у 5 из них обнаружен перикардиальный выпот. У 4 пациенток обнаружены диффузные затемнения в легких, у 6 узелки в легочном интерстиции, у 3 трех аденопатия лимфатических узлов (lymph node adenopathies). Не обнаружено плевральных бляшек (pleural plaques), утолщений плевры (pleural thickening) и узлов (pleural nodules). У всех пациенток выявлено воспаление легочного интерстиция и легочный фиброз. После 7 мес. наблюдения у двух пациенток (случаи 1 и 5) замечено быстрое прогрессирование легочного интерстициального фиброза и у одной образование кальцификатов в плевральной полости (случай 1).

Всем пациенткам была выполнена бронхоскопия, у 4 обнаружено увеличение и гиперемия tunica mucosa bronchiorum[2]. В жидкости бронхоальвеолярного лаважа количества макрофагов снижено, лимфоцитоз, нейтрофилез, количество эозинофилов соответствовало норме. Трахеобронхиальная легочная биопсия показала скопления фагоцитов, воспалительных клеток и белковые выпоты в альвеолярных пространствах, набухшие и расширенные альвеолярные септы с нейтрофильными лейкоцитами и участки легочного фиброза. Tunica mucosa bronchiorum инфильтрирована воспалительными клетками.

Торакоскопия, проведенная у трех пациенток, позволила обнаружить у двух из них ровные уплотнения на поверхности плевры, не имеющие отношения к злокачественным образованиям. Биопсия плевры и жидкости показала наличие гранулем, вызванных наличием инородного тела (foreign-body granulomas), геморрагии, воспалительные клетки.

Изучение грудной полости с помощью VATS позволило обнаружить отсутствие слипания плевральных листков. На биопсию были взяты участки плевры. С легочной поверхности плевры, где рассеяны маленькие туберкулы, взяты гистологические образцы из участков, соответствующих верхней, средней и нижней долям легкого. Световая микроскопия гистологических препаратов не дала ничего специфического: фиброзные уплотнения на поверхности плеврального листка; эмфиземо-подобные изменения легочных альвеол; расширение альвеолярных септ; отложение коллагеновых нитей; капилляры расширены, заполнены лимфоцитами; альвеолярные пространства инфильтрированы фагоцитами; в альвеолах встречаются многоядерные гигантские клетки; пролиферация альвеолярных эпителиальных клеток II типа.

Трансмиссионная электронная микроскопия дала более интересные результаты. Легочная ткань была повреждена. Обнаружены легочный интерстициальный отек; признаки гиперплазии и дегенерации пневмоцитов второго типа, почти утративших микроворсинки; уплотнение базальной мембраны альвеолярных эпителиальных клеток первого типа. Клетки сосудистого эндотелия имели признаки повреждения: они были увеличены, наблюдалась вакуолизация клеточных органелл и уплотнение базальной мембраны. В газобменной области альвеол барьер между альвеолярной стенкой и капиллярами был нечетким и значительно более толстым, чем в норме (норма ~ 500 нм).

В поздней стадии болезни повреждения легких, описанные выше,  были более выраженными. Барьер между альвеолярной стенкой и капиллярами в газобменной области альвеол был практически неразличим. В альвеолярном пространстве находили эритроциты, что указывало на наличие альвеолярной геморрагии и отека. Обнаружен легочный фиброз с пролиферацией фибробластов и фибринозный некроз. Плевральные мембраны отечные, рыхлые, с признаками фиброза и неясной клеточной структурой. Большое количество макрофагов образовывали агрегаты, что показывает их участие в развитии патологического процесса.

У пациентов на ранней стадии болезни (три месяца после появления первых симптомов) в цитоплазме, ядре и органеллах макрофагов, микрососудах легких, эндотелиальных клетках легочных сосудов, и в микролимфатических сосудах, в жидкости плеврального выпота были обнаружены наночастицы неизвестной природы диаметром ~20–2 нм. В альвеолярных эпителиальных клетках и интерстициальных тканях их тоже находили, но в значительно меньших количества. Размер наночастиц в жидкости плеврального выпота был меньшим, чем в тканях легких, что говорит о размерозависимой транслокации наночастиц по тканям легких. Для того что бы установить химическую природу наночастиц, использовался метод энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX). Он показал, что большинство наночастиц состоят из двуокиси кремния (рис. 7).

Рис. 7. Обнаружение в легочной ткани человека наночастиц двуокиси кремния и вызванные ими гистологические изменения.

Рис. 7. Обнаружение в легочной ткани человека наночастиц двуокиси кремния и вызванные ими гистологические изменения. А. Трансмиссионные электронномикроскопические изображения наночастиц в легочной ткани (случай 5). Наночастицы имеют размер 20–21 нм в диаметре, рассеяны по цитоплазме макрофага (размер маркерной полосы 200 нм). Б. Артефакт, который можно принять за наночастицы. Поэтому с помощью EDX устанавливается химический состав наноструктур (размер маркерной полосы 150 нм). В. Ранняя стадия болезни. Агрегация макрофагов в альвеолярном пространстве, набухание альвеолярной септы и легочный фиброз (окрашивание гемотокслином и эозином, увеличение в 100 раз). Г. Поздняя стадия болезни. Легочные альвеолы частично эмфизематозны с агрегированными макрофагами  и пролиферированными альвеолярными эпителиальными клетками второго типа. Альвеолярные септы и кровеносные сосуды расширены и застойны (окрашивание гемотокслином и эозином, увеличение в 100 раз). По [54].

 

 

В поздней стадии болезни (18 мес. от начала появления симптомов), небольшое количество наночастиц двуокиси кремния было обнаружено пульмонарных клетках (pulmonary cells), ткани интерстиция (interstitial tissue) и в макрофагах. Однако в ядрах и цитоплазме альвеолярных эпителиальных клеток были обнаружены отдельные нитчатые наноструктурные включения (длиной ~70 нм), сформировавшие сложные агломераты или пересекающие мембраны ядер альвеолярных эпителиальных клеток. Используя EDX исследователи установили, что нитчатые наноструктуры содержат Fe, Ca, Mg, но не Si. Эти структуры не были обнаружены в легочной ткани пациентов, что говорит за то, что они не имеют отношения к легочной патологии.

Нацеливание искусственных генетических наноконструкций на отдельные типы клеток человека. Для искусственных генетических конструкций на основе вирусов задача повышения или даже изменения их специфичности к отдельным типам клеток решается следующими путями:

физический таргетинг (physical targeting) заключается в том, что вирусная частица покрывается специальной оболочкой, изменяющий ее природный тропизм и делающей ее «неузнаваемой» для иммунной системы. В качестве такой оболочки используют полимеры (полиэтиленгликоль или poly-[N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide, pHPMA]) или вирусную частицу включают в биодеградируемую альгинатную микрочастицу. Природный тропизм вектора заменяется селективным таргетингом (selective targeting), т. е. в эти полимеры водятся различные таргетирующие лиганды (пептиды, белки или антитела). Другой стратегией для физического таргетинга стало использование биспецифических адапторных молекул (биспецифические антитела или белки слияния), состоящих из двух компонентов — один из них с высокой специфичностью связывается участком капсида искусственной генетической конструкции, другой с высокой специфичностью связывает рецептор клетки-мишени. Обе стратегии физического таргетинга в основном используются для изменения специфичности векторов на основе  аденовирусов, однако они дают плохо воспроизводимые результаты [50]. Поэтому физическому таргетингу исследователи предпочитают генетическую модификацию векторов на основе вирусов;

генетический таргетинг (genetic targeting) объектом модификации генно-инженерными способами становятся белки капсида вируса, играющий основную роль в специфическом узнавании клеток-мишеней. Для векторов на основе аденовирусов объектом модификации обычно является волокнистый «набалдашник» капсида, играющий основную роль в специфическом узнавании аденовирусом клеток-мишеней, и, в частности, расположенные на нем два участка: C-конец и HI-петля [50].

Для векторов на основе лентивирусов эта задача может решаться благодаря псевдотипированию вируса. Смысл методического приема в следующем. Так как из лентивирусной векторной системы удален собственный оболочечный ген env ВИЧ, то его можно заменить на другой, направляющий синтез оболочечного гликопротеина другого вируса, чью специфичность исследователям необходимо использовать для введения генов в клетки-мишени. Такие вирусы называют псевдотипированными (pseudotyping) или вирусами-обманщиками [46].

Например, химерный гликопротеин RD114, полученный благодаря слиянию трансмембранного и внеклеточного доменов гликопротеина эндогенного ретровируса кошачьих (feline endogenous virus RD114) с цитоплазматическим доменом гликопротеина амфотропного вируса MLV 4070A, позволяет псевдотипированному вектору эффективно трансдуцировать мезенхимальные стволовые клетки (mesenchymal stem cells, MSCs) с очень низкой цитотоксичностью [62].

Лентивирусные векторы, псевдотипированные с гликопротеинами оболочки вируса бешенства (PV-штамм), приобретают тропность к нейрональной ткани и способность к ретроградному транспорту в условиях in vivo. Введенный в периферерическом участке нервной системы псевдотипированный лентивирусный вектор по нейрональным аксонам доставил трансгены в ЦНС [19]. Подробно стратегия использования таких векторов для целей генотерапии, описана в работах [16, 20, 46, 60].

Для искусственных векторных систем задача повышения специфичности к отдельным типам клеток решается путем введения в их поверхность лигандов, специфически взаимодействующих с рецепторами на поверхности клеток-мишеней. Введение в состав липосомы галактолипидов повышает их тропность к паренхиматозным тканям. Липосомы, содержащие dimethylaminoethane-carbamoyl-cholesterol (DC-Chol), обладают повышенной тропностью к клеткам гиппокампа головного мозга[3] [28]. Другой путь таргетироваия липоплексов — введение в их состав специфических антител. Такие комплексы называются ПЭГилированными иммуносомами (PEGylated immunoliposomes, PILs). Они сохраняют коллоидную стабильность при внутривенном введении, и эффективно доставляют гены в ЦНС [45, 62].

 Наибольшую эффективность при доставке генов в ЦНС показали полиплексы на основе PEI. Их трансфецирующая активность превосходит таковую у векторов, полученных на основе ВИЧ-1, сопоставима с трансдуцирующей активностью аденовирусов, но уступает векторам на основе HSV [9].

Тонкое управление специфичностью искусственных векторных систем стало возможным благодаря обнаружению на поверхности нейронов нескольких классов рецепторов, с которыми взаимодействуют нейропептиды, нейротрофины и нейротоксины. Для перенацеливания искусственных векторных систем с одного участка мозга на другой в их состав включают таргетинговые группы, соответствующие отдельному классу рецепторов (табл. 4).

 

Таблица 4 – Нейрон-таргетирующие лиганды, используемые при конструировании искусственных векторных систем, предназначенных для доставки генов в ЦНС*

Класс лиганда

Примеры лигандов

Таргетируемые популяции нейронов

Нейропептиды

Нейротенсин

Нигростинальнальная и мезолюмбальная системы

Нейротрофины

Фактор роста нерва

Дорсальный корневой ганглий, симпатические сенсорные нейроны, нейроны базального отдела переднего мозга

Нейропептиды

Столбнячный токсин

Все периферические нейроны (относящиеся к вегетативной нервной системе, моторные и сенсорные)

* По [8].

 

Эффективная нейрон-специфическая трансфекция искусственных векторных систем достигается введением в их оболочку химерного белкового комплекса, включающего четвертую петлю фактора роста нервов (nerve growth factor, NGF) или шпилечный мотив, содержащий петли 1 и 2 NGF, слитый с ДНК-связывающим доменом из 10 лизиновых последовательностей [61]. Трансфецирующая активность в отношении нейронов, сравнимая с трансдуцирующей активностью HSV, в условиях in vivo показана для наночастиц (~30 нм), созданных на основе кремния, модифицированного путем добавления аминогрупп (amino-terminated organically modified silica, ORMOSIL) и комплексированных с плазмидной ДНК [10].

Наряду с разработкой типовых структур искусственных векторных систем для направленной доставки трансгенов в целевые клетки (в печень, в мозг и надпочечники, в медуллярные двигательные нейроны, в костные ткани, в гладкую мускулатуру кровеносных сосудов, в опухоли эндотелия и др.), в 1990-е гг. была оптимизирована структура трансгена. Для того чтобы трансген мог автономно функционировать в данной ткани, в него включают соответствующие регионы транскрипции и инициации мРНК, регуляции терминации транскрипции.

Нацеливание искусственных генетических наноконструкций на отдельные участки генома человека. В первом десятилетии текущего века наиболее распространенным подходом к нацеливанию ретровирусного вектора на конкретные участки в геноме человека было использование в составе вирусной частицы слитых белков, образующих вирусный преинтеграционный комплекс, импортирующийся вовнутрь нуклеуса. Такие белки обычно включают IN-белок (вирусная интеграза), полученный из ВИЧ-1; и ДНК-связывающие последовательности клеточных и бактериальных белков, слитых с N- или C-концом IN. Что бы вирус не утратил инфекционности, слитые белки вводят в вирион ВИЧ-1 вместе с исходным IN (wild-type IN). Одна из используемых моделей нацеливания ретровирусных векторов на конкретные участки ДНК в геноме человека (таргетинговой интеграции), показана на рис. 8.

Случаи поражения людей искусственными генетическими наноконструкциями. Такие поражения имели место при введении людям искусственных генетических наноконструкций на основе аденовирусов и ретровирусов.

Наиболее тяжелые генетические последствия наблюдали при терапевтическом использовании ретровирусных векторов для лечения пациентов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, связанным с Х-хромосомой (X-linked severe combined immunodeficiency, X-SCID). Иммунодефицитное состояние у таких пациентов возникает из-за мутации в гене гамма-субъединицы рецептора интерлейкина 2 (interleukin-2 receptor subunit gamma gene, IL2RG), общей для рецепторов интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21.

Рис. 8. Модель таргетинговой интеграции ретровирусных векторов.

Рис. 8. Модель таргетинговой интеграции ретровирусных векторов. Интеграция осуществляется посредством использования модифицированной интегразы, слитой гетерологичными ДНК-связывающими доменами. DBD — ДНК-связывающий домен (DNA-binding domain); IN — интеграза. TS — белок, образовавшийся в результате слияния DBD и IN. Преинтеграционный комплекс интегрируется с участком хромосомной ДНК (target site, TS), узнаваемым DBD. По [44]

 

Эти интерлейкины и их рецепторы вовлечены в процессы развития T- и B-лимфоцитов. Без функционирования Т-клеток невозможна активизация В-клеток. Ген IL2RG находится на Х-хромосоме. Мутация в гене IL2RG приводит к инактивации общей гамма-цепи рецепторов интерлейкинов, и, как следствие, нарушаются процессы сигнализации, в которых они участвуют. Происходит почти полный отказ иммунной системы с отсутствием или очень малым количеством T-лимфоцитов, NK-клеток и нефункциональными B-лимфоцитами. Дети с X-SCID погибают от инфекции в течение года [57].

Так как X-SCID вызван мутацией в одном хорошо охарактеризованном гене, его лечение путем введения пациенту полноценного гена в конце 1990-х гг. представлялось исследователям одним из самых перспективных направлений в генотерапии. Группой французских исследователей из костного мозга 9 пациентов в возрасте от 1 до 9 мес. были получены аутологичные гемопоэтические стволовые клетки CD34+. Эти клетки культивировали в условиях ex vivo и трансдуцировали ретровирусным вектором на основе вируса мышиной лейкемии Молони, в который включили ген IL2Rγc человека. Затем клетки вводили обратно пациентам. Функция Т-клеток постепенно восстановилась. В течение нескольких месяцев количество Т-клеток и натуральных киллеров в крови у 8 пациентов достигло нормы. Был установлен минимальный порог количества трансдуцированных клеток, которое необходимо ввести пациенту для достижения терапевтического эффекта — 1?106–3?106 CD34+-клеток/кг массы тела. Однако почти 11-летнее наблюдение дало обескураживающие результаты: у четырех пациентов в течение 31–68 мес. развился острый Т-клеточный лейкоз, и один из них умер [25, 26]. Причиной развития острого лейкоза стала интеграция ретровирусного вектора вблизи нескольких протоонкогенов и перестройка генома клеток-мишеней, приведшие к многокаскадной активации протоонкогенов и, как следствие, неконтролируемой пролиферации Т-клеток (рис. 9).

 

 

 

 

Рис. 9. Развитие острого лейкоза у четырех пациентов после введения ретровирусной искусственной генетической наноконструкции.

Рис. 9. Развитие острого лейкоза у четырех пациентов после введения ретровирусной искусственной генетической наноконструкции. А. Терапевтический эффект. Б. Развитие острого лейкоза. У двух пациентов (№№ 4, 5) геном бластных клеток[4] включает активный вектор вблизи протоонкогена LMO2. У пациента № 10 бластные клетки содержат интегрировавший вектор вблизи протоонкогена LMO2 и второй интегрировавший вектор вблизи протоонкогена BMI1. У пациента № 7 бластные клетки содержат интегрировавший вектор вблизи протоонкогена CCND2. Хромосомные транслокации, вызванные интеграцией вектора, у некоторых пациентов привели к активизации протоонкогена NOTCH1, делеции гена CDKN2, супрессирующего развитие опухолей, и к перестройке гена SIL-TAL1, приведшие к неконтролируемой пролиферации Т-клеток. У пациентов №№ 4 (умер) и пациента № 7 обнаружены обширные делеции хромосомы 6q16-16. По [24, 43]

 

Наиболее часто вовлекаемый в онкогенез ген LMO2 (LIM domain–only 2) локализован у человека на 11-й хромосоме. Он экспрессируется в ядре клетки и действует как транскрипционный активатор факторов, необходимых для дифференциации эритроцитов в костном мозге. В норме ген LMO2 экспрессируется в различных тканях, таких как почки, печень, легкие, селезенка и ЦНС, участвует в ангиогенезе. Однако его активизация в Т-клетках в результате встраивания ретровируса или хромосомной транслокации, приводит их к неконтролируемому размножению и развитию острого Т-клеточного лейкоза. Химиотерапия оказалась успешной у трех пациентов с развившимся лейкозом. Она позволила добиться восстановления поликлональных трансдуцированных T-клеточных популяций [24, 37, 57].

S. E. Raper et al. [46] описали случай летального исхода при лечении пациентов с врожденным дефицитом отрнитинтранскарбамилазы (ornithine transcarbamylase, OTC). Мужчине 18 лет, участвовавшем в пилотном проекте по оценке безопасности нового метода генной терапии, была введена векторная наноконструкция на основе человеческого аденовируса 5 типа с делетированными генами E1 (необходим для репликации вируса) и E4 (участвует в регуляции транскрипции вирусной ДНК), включающий клонированную кДНК гена OTC человека. Пациенту было введено через правую печеночную артерию 6x1011 векторных частиц/кг. Приблизительно через 18 ч были замечены изменения в его психике и развитие желтухи, чего не наблюдалось у первых 17 пациентов, участвовавших в этом же исследовании. В дальнейшем у пациента развились диссеминированная внутрисосудистая коагуляция (disseminated intravascular coagulation), синдром системного воспалительного ответа (systemic inflammatory response syndrome) и множественная органная недостаточность, приведшие его к смерти через 98 ч после введения аденовирусного вектора. При посмертном исследовании вектор с клонированным геном обнаружен почти во всех тканях погибшего пациента. Причины его смерти авторами не объяснены. Ими только сделан вывод, что такие способы лечения нуждаются в значительно большем количестве опытов на животных, чем было проведено, и изучения возможных иммунных ответов у пациента.

Распознание поражения людей нанообъектами. Самым трудным в распознании таких поражений будет определение случая поражения, т. е. формирование стандартного клинического, паталогоанатомического и патоморфологического описания случая болезни, вызванного определенным типом нанообъекта. Сделать предположение о поражении нанообъектами (среди других причин) отдельных лиц или групп населения можно на основе сопоставления их анамнеза и клинических проявлений поражения. Например, развитие однотипных онкологических процессов у объединенных общей идеей (врагом) политических деятелей, или развитие медленно прогрессирующей легочной патологии у рабочих, занятых на одном производстве. Однако для установления фактора нанообъекта в развитии патологии пациента необходимо: 1) для наночастиц известных веществ, полученных дезагрегированием или конденсацией — обнаружение этих наночастиц в пораженных тканях; 2) для доставленных в клетки-мишени векторных конструкций — обнаружение векторных молекул вместе с трансгенами и с соответствующими регионами транскрипции и инициации мРНК.

Первый подход хорошо иллюстрируется приведенным выше описанием группового поражения людей наночастицами двуокиси кремни, где в установлении связи между патоморфологией и наличием наночастиц основную роль сыграла трансмиссионная электронная микроскопия, а в определении химической природы наночастиц — метод EDX. Второй подход иллюстрирован примерами с поражениями людей векторными конструкциями на основе ретровируса мышиной лейкемии Молони и человеческого аденовируса 5 типа. И в том и в другом случае в тканях-мишенях жертв этих экспериментов были обнаружены векторные конструкции с клонированными в них трансгенами и регуляторными элементами. Случай с развитием острого лейкоза у детей очень показателен для разработки подходов к выявлению таких поражений. Для гена LMO2 ранее уже было показано участие в развитие острого лейкоза, когда в основе механизма его активизации в Т-клетках лежат спонтанные перестройки (транслокации) хромосомы 11. Однако в случае искусственно вызванной у детей лейкемии было обнаружено, что этот ген в Т-клетках находится под контролем LTR[5] вируса мышиной лейкемии Молони, в геноме человека никогда ранее не встречавшегося.

Для сбора данных об обстоятельствах, приведших к поражению нанообъектами и масштабах поражения, проводится анализ научной литературы на предмет описания сходных случаев и выстраиваются аналогии. Так же анализируются истории болезни в стационарах и поликлиниках, поднимаются протоколы патологоанатомических вскрытий, собираются и исследуются соответствующими методами образцы тканей пациентов, подпадающих под описание данного случая поражения нанообъектами. Проводятся опросы (анкетирование) установленных пораженных и их лечащих врачей; выполняются медицинские осмотры лиц, находившихся на территории, где произошло поражение, или взаимодействующих с факторами, которые могут привести к такому поражению, но пока не имеющих клинических признаков болезни.

***

Нанообъекты представляют собой новую биологическую угрозу, с трудно прогнозируемым поражающим потенциалом. Они способны вызывать массовые смертельные поражения людей, проявляющиеся клиникой болезни, неизвестной врачам, либо она может маскироваться под уже известные описания, однако иметь совершенно иную этиологию, чем та, что традиционно рассматривается врачами при выборе способов лечения пациентов. Среди наночастиц известных веществ, полученных путем их дезагрегирования или конденсирования, наибольшую опасность представляют объекты, имеющие размер менее 50 нм; формирующие инкапсулирующие структуры; и подвергнутые биофункционализации. Среди искусственно созданных наноконструкций, способных переносить генетическую информацию, наибольшую опасность для здоровья людей представляют наноструктуры на основе ретровирусных векторов и искусственные векторные системы. Уже сегодня в рамках технологий их создания возможно получение нанобъектов, обладающих способностью проникать в любые клетки-мишени и распространяться любым способом, включая ингаляционный и, даже, парэнтерально, через массовую вакцинацию.

 

Список сокращений, нераскрытых в тексте

В/б — внутрибрюшинное введение

ВИЧ — вирус иммунодефицита человека

ВЭЛ — вирус энцефалита лошадей

ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

И/т — интратрахеальное введение

кДа — килодальтон.

мкм — микрон.

нм — нанометр.

ПЭГ — полиэтиленгликоль

РЭС — ретикулоэндотелиальная система

СОЭ — скорость оседания эритроцитов

т.п.о. — тысяча пар оснований

ЦНС — центральная нервная система

ALT (alanine aminotransferase) — аланинаминотрансфераза

AST (aspartate aminotransferase) — аспартатаминотрансфераза

CAEV (Сaprine arthritis-encephalitis virus) — вирус артрита-энцефалита коз

EDX (energy-dispersive X-ray spectroscopy) — метод энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии

EIAV (Infectious anemia virus) — вирус инфекционной анемии лошадей

FIV (Feline immunodeficiency virus) — вирус иммунодефицита кошачьих

HSV (Herpes simplex virus) — вирус герпеса простого

JDV (Jembrana disease virus) — вирус болезни Джембрана (лентивирус, вызывающий иммунодефицит у крупного рогатого скота)

LTR (viral long terminal repeat) — вирусный длинный терминальный повтор

MLV (Moloney Murine leukemia virus) — вирус мышиной лейкемии Молони

MVV (Maedi-Visna virus) — вирус Висна-Маэди

MWCNT (multiwall carbon nanotube) — мультистеночные углеродные нанотрубки.

PEI (polyethylene imine) — полиэтиленимин

SWCNT (single-wall carbon nanotube) — одностеночные углеродные нанотрубки.

VATS (video-assisted thoracic surgery) — оперативное вмешательство на грудной клетке под видеонаблюдением

 

Список использованных источников

1. Головин Ю. И. Введение в нанотехнику. — М., 2007.

2. Гусев А. И. Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. — М., 2007.

3. Де Лазари А. Н. Химическое оружие на фронтах мировой войны. — М., 1935.

4. Суздалев И.П. Физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов. М., 2009.

5. Хлопин Г. В. Военно-санитарные основы противогазового дела. — Л.,  1930.

6. Ariano P., Zamburlin P., Gilardino A. et al. Interaction of spherical silica nanoparticles with neuronal cells: size-dependent toxicity and perturbation of calcium homeostasis // Small. — 2011. — Vol. 7. — P. 766–774.

7. Banerjee R. Nanoparticle aerosols: boon or bane for breathing? // Nanomedicine. — 2012. — Vol. 7, № 6. — 795–798.

8. Bergen J. M., Park In-Kyu, Horner P. J. et al. Nonviral approaches for neuronal delivery of nucleic acids // Phar. Res. — 2008. — Vol. 25, № 5. — P. 983–998.

9. Berry B., Barrett L., Seymour L. et al. Gene therapy for central nervous system repair // Curr. Opin. Mol. Ther. — 2001. — Vol. 3. — P. 338–349.

10. Bharali D. J., Klejbor I., Stachowiak E. et al. Organically modified silica nanoparticles: a nonviral vector for in vivo gene delivery and expression in the brain // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 2005. — Vol. 102. — P. 11539–11544.

11. Boeckle S., Wagner E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems // AAPS J. — 2006. — Vol. 8, № 4. — P. 731–742.

12. Bonner J. S. Nanoparticles as a potential cause of pleural and interstitial lung disease // Proc. Am. Thorac. Soc. — 2010. — Vol. 7. — P. 138–141.

13. Brown D. M., Wilson M. R., MacNee W. et al. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine poly-styrene particles: a role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 2001. — Vol. 175. — P. 191–199.

14. Cheang Tuck-yun, Tang Bing, Xu An-wu et al. Promising plasmid DNA vector based on APTESmodified silica nanoparticles // Intern. J. of Nanomed. — 2012. — Vol. 7 — P. 1061–1067.

15. Choi H. S., Ashitate Y., Lee Rapid J. H. et al. Translocation of nanoparticles from the lung airspaces to the body // Nat Biotechnol. — 2010. —  Vol. 28, № 12. — 1300–1303.

16. Cronin J., Zhang X. Y., Reiser J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping // Curr. Gene. Ther. — 2005. — Vol. 5. — P. 387–398.

17. Davis P. B., Cooper M. Vectors for airway gene delivery // AAPS J. — 2007. — Vol. 9, № 1. — E11–E17.

18. Donaldson K., Tran T. Inflammation caused by particles  and fibers // Inhal. Toxicol. — 2002. — Vol. 14. — P. 5–27.

19. Federici T., Kutner R., Zhang X. Y. et al. Comparative analysis of HIV-1-based lentiviral vectors bearing lyssavirus glycoproteins for neuronal gene transfer // Genet. Vaccin. Ther. — 2009. — Vol. 7, № 1.

20. Frecha C., Szecsi J., Cosset F. L. et al. Strategies for targeting lentiviral vectors // Curr. Gene Ther. — 2008. — Vol. 8. — P. 449–460.

21. Frohlich E., Roblegg E. Models for oral uptake of nanoparticles in consumer products // Toxicology. — 2012. — Vol. 291. — P. 10–17.

22. Goldberg M., Langer R., Jia X. Nanostructured materials for applications in drug delivery and tissue engineering // J. Biomater. Sci. Polym. — 2007. — Vol. 18, № 3. — P. 241–268.

23. Goncalves D. M., de Liz R., Girard D. Activation of neutrophils by nanoparticles // The Sci. World J. — 2011. — Vol. 11. — P. 1877–1885.

24. Hacein-Bey-Abina S., Garrigue A., Wang C. P. et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1 // J. Clin. Invest. — 2008. — Vol. 118. — P. 3132–3142.

25. Hacein-Bey-Abina S., Hauer J., Lim A. et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency // N. Engl. J. Med. — 2010. — Vol. 363, № 4. — P. 355–364.

26. Hacein-Bey-Abina S., le Deist F., Carlier F. et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy // N. Engl. J. Med. — 2002. — Vol. 346. — P. 1185–1193.

27. Halama A., Kulinski M., Librowski T. et al. Polymer-based non-viral gene delivery as a concept for the treatment of cancer // Pharm. Rep. — 2009. — Vol. 61. — P. 993–999.

28. Harvie P., Wong F. M, Bally M. B. Use of poly(ethylene glycol)–lipid conjugates to regulate the surface attributes and transfection activity of lipid–DNA particles // J. Pharm. Sci. — 2000. — Vol. 89. — P. 652–663.

29. Hartzell J., Wood-Morris R., Martinesz L. et al. Q fever: epidemiology, diagnosis, and treatment // Mayo Clin. Proc. — 2008. — Vol. 83, № 5. — P. 574–579.

30. Hoet P., Brüske-Hohlfeld I., Salata O. Nanoparticles – known and unknown health risks // J. Nanobiotech. — 2004. — Vol. 2 .

31. Inder M. V., Nikunj S. Gene therapy promises, problems and prospects // Nature. — 1997. — Vol. 389. — P. 239–242.

32. Jo D. H., Lee T., Kim J. H. Nanotechnology and nanotoxicology in retinopathy // Int. J. Mol. Sci. — 2011. — Vol. 12. — P. 8288–8301.

33. Krug H.F., Wick P. Nanotoxicology: an interdisciplinary challenge // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. — 2011. — Vol. 50. — P. 1260–1278.

34. Li N., Sioutas C., Cho A. et al. Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage // Environ. Health. Perspect. — 2003. — Vol. 111. — P. 455–460.

35. Lockman P. R., Koziara J. M., Mumper R. J. et al. Nanoparticle surface charges alter blood-brain barrier integrity and permeability // J. Drug Target. — 2004. — Vol. 12. — P. 635–641.

36. Mataraza C., Qin Z. H., Huang Z. et al. Highly efficient molecular delivery into mammalian cells using carbon nanotube spearing // Nature Methods. — 2005. — Vol. 2. — P. 449–454.

37. McCormack M. P., Rabbitts T. H. Activation of the T-cell oncogene LMO2 after gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency // N. Engl. J. Med. — 2004. — Vol. 350. — P. 913–922.

38. Morimoto Y., Kobayashi N., Shinohara N. et al. Hazard assessments of manufactured nanomaterials // J. Occup. Health. — 2010. — Vol. 52. — P. 325–334.

39. Mortensen L. J., Oberdorster G., Pentland A. P. et al. In vivo skin penetration of quantum dot nanoparticles in the murine model: the effect of UVR // Nano Lett. — 2008. — Aug 8.

40. Murphy F. A., Schinwald A., Poland C. A. et al. The mechanism of pleural inflammation by long carbon nanotubes: interaction of long fibres with macrophages stimulates them to amplify proinflammatory responses in mesothelial cells // Particle and Fibre Toxicology. — 2012. — Vol. 9, № 8 (http://www.particleandfibretoxicology.com/content/9/1/8).

41. Nemmar A., Hoet P., Vanquickenborne B. et al. Passage of inhaled particles into the blood circulation in humans // Circulation. — 2002. — Vol. 105. — P. 411–414.

42. Nemunaitis J., Edelman J. Selectively replicating viral vectors // Canc. Gen. Ther. — 2002. — Vol. 9. — P. 987–1000.

43. Noguchi P. Risks and benefits of gene therapy // N. Engl. J. Med. — 2003. — Vol. 348, № 3. — P. 193–192.

44. Oberdörster G., Oberdörster E., Oberdörster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles // Environ. Health. Perspect. — 2005. — Vol. 113. — P. 823–839.

45. Pardridge W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular Trojan horses // Nat. Rev. Drug. Discov. — 2002. — Vol. 1. — P. 131–139.

46. Pluta K., Kacprzak M. M. Use of HIV as a gene transfer vector // Act. Biochim. Pol. — 2009 — Vol. 56, № 4. — P. 531–595.

47. Prabhu B. M., Ali S. F., Murdock R. C. et al. Copper nanoparticles exert size and concentration dependent toxicity on somatosensory neurons of rat. Nanotoxicol. — 2010. — Vol. 4. — P. 150–160.

48. Raper S. E., Chirmule N., Lee F. S. et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer // Mol. Genet. Metab. 2003. Vol. 80 (1–2). P. 148–158.

49. Sena-Esteves M., Saeki Y., Fraefel C. et al. HSV-1 amplicon vectors — simplicity and versatility // Mol. Ther. — 2000. — Vol. 2, № 1. — P. 9–15.

50. Sharma A., Lia X., Bangari D. S. et al. Adenovirus receptors and their implications in gene delivery // Virus. Res. — 2009. — Vol. 143, № 2. — P. 184–194.

51. Shvedova A., Kisin E., Mercer R. et al. Unusual inflammatory and fibrogenic pulmonary responses to single-walled carbon nanotubes in mice // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. — 2005. — Vol. 289. — L698–L708.

52. Skocaj M., Filipic M., Petkovic J. et al. Titanium dioxide in our everyday life; is it safe? // Radiol. Oncol. — 2011. — Vol. 45. — P. 227–247.

53. Smith P., Giroud M., Wiggins H. et al. Cellular entry of nanoparticles via serum sensitive clathrin-mediated endocytosis, and plasma membrane permeabilization // Inter. J. of Nanomed. — 2012. — Vol. 7. — P. 2045–2055.

54. Song Y., Li X., Wang L. et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage // Toxicol. Pathol. — 2011. — Vol. 39. — P. 841–849.

55. Song Y., Li X., Du X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma // Eur. Respir. J. — 2009. — Vol. 34. — P. 559–567.

56. Stern S., McNeil S. Nanotechnology safety concerns revisited // Toxicol. Sci. — 2008. — Vol. 101. — Vol. 4–21.

57. Strauss B.E., Costanzi-Strauss E. Combating oncogene activation associated with retrovirus-mediated gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency // Brazil. J. .Med. Biol. Res. — 2007. — Vol. 40. — P. 601–613.

58. Tinkle S. S., Antonini J. M., Rich B. A. et al. Skin as a route of exposure and sensitization in chronic beryllium disease // Environ. Health. Perspect. — 2003. — Vol. 111. — P. 1202–1208.

59. Win-Shwe Tin-Tin., Fujimaki H. Nanoparticles and neurotoxicity // Int. J. Mol. Sci. — 2011. — Vol. 12. — P. 6267–6280.

60. Verhoeyen E., Cosset F. L. Surface-engineering of lentiviral vectors // J. Gene Med. — 2004. — Vol. 6 (Suppl 1). — P. 83–94.

61. Zeng J., Wang S. Enhanced gene delivery to PC12 cells by a cationic polypeptide // Biomaterials. — 2005. — Vol. 26. — P. 679–686.

62. Zhang J. Evolution by gene duplication: an update // Trends. Ecol. Evol. — 2003. — Vol. 18. — № 6. — P. 292–298.

 

Библиографическое описание:

Супотницкий М.В. Нанообъекты как новая биологическая угроза // Нанотехнологии и охрана здоровья. — 2013. — № 4. — С. 22–41.

 

 

Ссылки по теме:

Супотницкий М.В. Биологическая война. Введение в эпидемиологию искусственных эпидемических процессов и биологических поражений. М., 2013.

Супотницкий М.В. Распознание поражений рицином // Прикладная токсикология. — 2013. — № 1 (9). — № 44–49.

Супотницкий М.В. Распознание поражения палитоксином // Жизнь без опасностей. — 2013. — № 3. — С. 56–67.

Супотницкий М.В. Эпидемиология искусственных эпидемических процессов как третий раздел эпидемиологии // Новости медицины и фармации. — 2013. — № 5 (449).

Супотницкий М.В. Ещё не получали белый порошок? Тогда мы идём к вам! // Свободная пресса.— 2012 .— Интервью от 9 и 17 июля.

Супотницкий М. В. Развитие биологического оружия еще не начиналось. Беседа с журналистом Иваном Ленцевым (полная версия) // Солдаты России. — 2009. — № 7–9. — С. 76–86.

 

Цикл статей по истории биологического оружия

I. Боги-«биотеррористы» и древние отравители // Офицеры. — 2011. — № 5. — С. 56-61.

II. Средневековые «сеятели чумы» // Офицеры. — 2011. — № 6. — С. 56-61.

III. Бактериологические диверсии Первой мировой // Офицеры. — № 1. — С. 58–63.

 IV. Между мировыми войнами. Ученые и военные блуждали в «бактериальном тумане» и витали в «микробных облаках» // Офицеры. — 2012 — № 2. — С. 62–67.

V. Крах «отряда 731» // Офицеры. — 2012 — № 3. — С. 62–67.

VI. Повелители эпидемий // Офицеры. — 2012 — № 5. — С. 56–61.

VII. Бактериологическая война в Корее // Офицеры 2013. № 1. С. 58–63.

ПОКАЗАНИЯ ВОЕННОПЛЕННЫХ АМЕРИКАНСКИХ ЛЕТЧИКОВ, ПРИМЕНЯВШИХ БО В 1952 Г. ВО ВРЕМЯ ВОЙНЫ НА КОРЕЙСКОМ ПОЛУОСТРОВЕ

VIII. От расцвета до запрета // Офицеры — 2013. — № 3. — С. 58–61.

IX. Миф массового поражения. Почему США окружают Россию военно-биологическими лабораториями и способствуют профанации эпидемиологии // Офицеры — 2013. — № 5. — С. 60–65.

 

ЗАБЫТАЯ ХИМИЧЕСКАЯ ВОЙНА 1915-1918 гг.

(цикл статей о применении химического оружия в годы Первой мировой войны):

I. Отравляющие вещества и химическое оружие Первой мировой войны // Офицеры. — 2010. — № 3 (47). — С. 56–61.

II. Тактическое применение химического оружия в годы Первой мировой войны // Офицеры. — 2010. — № 4 (48). — С. 52–57.

III. Применение химического оружия в операциях Первой мировой войны // Офицеры. — 2010. — № 5 (49). — С. 54–59.

IV. Химическая война в России // Офицеры. — 2010. — № 6 (50). — С. 52–57.

V. От «шлема Гипо» — к защите Зелинского. Как совершенствовались противогазы в годы Первой мировой войны // Офицеры. — 2011. — № 1 (51). — С. 50–55.

VI. Адское пламя. Огнеметы Первой мировой войны // Офицеры. — 2011. — № 2 (52). — С. 56–61.

VII. Отложенный апокалипсис. Почему Вторая мировая война не стала химической // Офицеры. — 2011. — № 3 (53). — С. 56–61.

 

 



[1] По работам Y. Song et al. [54, 55].

[2] Tunica mucosa bronchiorum — слизистая оболочка бронхов.

[3] Гиппокамп — центральная часть лимбической системы — комплекса структур среднего, промежуточного и конечного мозга, участвующих в организации висцеральных, мотивационных и эмоциональных реакций организма.

[4] Blast cells — незрелая клетка-предшественник.

[5] Область U3 каждого LTR несет промотор, запускающий экспрессию, находящегося вблизи гена.